| 今年以来，江苏、湖北、四川等多地的大规格草鱼发病，发病急、死亡量大，给养殖户带来了严重的损失。患病鱼多表现为赤皮、烂鳃、肠炎等典型的“老三病”症状，但按老三病处理，未能有效控制疫情，导致近段时间内草鱼“怪病论“在行业间蔓延。各方专家或行业从业者结合自身的研究特点，给出了各自的诊治方案。“老三病”、“真菌”、“冬季管理不善”、“体表受伤”等各种说法在自媒体广泛传播。以往的诊断与处置方案中多从细菌/真菌等角度出发，采用消毒与体内抗菌等方法控制疫情，但效果似乎不太理想，提示存在其它病原的可能。本实验室自湖北省某养殖场采集了部分典型患病鱼，开展了较为详细的实验室检测，探讨其病因，以期对本轮草鱼疫情的防控提供线索。 一、材料与方法 1、病料来源 患病鱼采集自湖北省武汉市江夏区某养殖场两个草鱼养殖发病塘。其中1号塘面积约为35亩，水深4m，原存塘量约20万斤；2号塘面积约15亩，水深2m，存塘量约为5万斤。水源为活水，水质指标如表1所示。
表1，发病塘水质部分理化指标 该养殖场自3月4日开始发病，1号塘一天损鱼约7000斤，2号塘损鱼约2000斤，这种爆发性死亡持续时间近半个月，1号塘损鱼约8万斤，2号塘损鱼约2万斤，发病初期典型症状为水霉烂鳃，中期为烂身烂尾，后期持续至4月初，后期死亡量较少。 从发病初至今，养殖场已规范使用包括恩诺沙星在内的多种抗生素拌料投喂，均无明显的治疗效果。期间，也采取了芽孢杆菌改水、消毒以及杀虫等措施，也未能有效控制草鱼的死亡。
图1 江夏某养殖场发病塘 2、细菌学分析 自患病鱼的肝、脾、肾以及未穿孔的疥疮病灶划线接种BHI培养基，经28℃培养过夜，挑选不同菌落形态的菌再次划线，纯种培养后经16S rDNA鉴定细菌种属。 使用康为世纪DNA提取试剂盒，按操作步骤提取待检菌DNA，以细菌16S rDNA的通用引物 27F/1492R（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG / GGTTACCTTGTTACGACTT）进行扩增。PCR扩增体系(50µL):10 × PCR缓冲液5µL，2.5 mM dNTPs 4µL，上游引物27F和下游引物1492R各1µL，Taq DNA(5 units/µL)聚合酶0.5µL，灭菌水36.5µL，DNA模板2µL。反应条件为：94℃、3min，94℃、35s，55℃、40s，72℃、2 min，经35个循环后72℃延伸10 min。扩增产物经电泳后切取目标条带，经胶回收试剂盒回收后测序。 待测菌对恩诺沙星、复方新诺明和诺氟沙星的敏感性以纸片扩散法（K-B法）测定。 3、病毒学分析 取患病鱼的脾、肾组织，以Trizol提取组织总RNA，经反转录后，以RT-PCR法检测患病鱼是否携带鲤春病毒血症病毒（Spring viremia of carp virus, SVCV）。同时，病料经预处理后接种至EPC细胞，用于增殖潜在的病毒。 二、结果 1、临床病症 自发病塘捞取数尾游水鱼用于检测。该养殖场发病鱼个体较大，死亡个体体重均超过1kg，现场采集的患病个体均在2kg以上。患病鱼鳞片脱落，体表出血，胸鳍、背鳍有不同程度的出血，烂尾、烂鳃明显。患病个体体表有疥疮病灶，轻压其体表病灶周边会有脓液流出，图2c显示头部尚未穿孔的疥疮病灶。部分鱼眼球浑浊（图2d）。解剖可见肝脏发白或呈花肝，脾脏肿大明显，肠道内无食物（图3）。
图2 江夏某养殖场患病个体典型临床病症
图3 江夏某养殖场患病个体典型解剖病症 2、细菌学分析 实验室结果显示，自患病鱼个体的肝、脾、肾分离出多株条件致病菌，经鉴定为气单胞菌属的成员，包括嗜水气单胞菌和唯氏气单胞菌。另外，自其中1条患病鱼肝分离出一株芽孢杆菌。药敏分析显示分离的细菌对新霉素、恩诺沙星和诺氟沙星敏感。
表2、部分菌株的药物敏感性测试结果 3、病毒学分析 以SVCV的特异性引物（SVCVF/R）进行RT-PCR检测，并对扩增产物进行测序验证。结果显示采集的9条患病鱼脾和肾均呈SVCV阳性（图4），测序显示同SVCV强毒株（Fijan株）糖蛋白基因（SVCV-G）相似性为100%，同国内自草鱼分离的强毒株（SH160901）相似性较低，同国内分离的其它弱毒株（SH150524，SH150524等）相似性也较低。患病样品接种EPC细胞也显示，EPC细胞呈现典型的细胞病变特征。
图4 江夏某养殖场患病鱼鲤春病毒血症病毒检测 其中1-9为患病鱼1-9的脾检测结果，10-18为患病鱼1-9的肾检测结果，M为低分子量Marker，阴性对照为不带毒的草鱼组织样本，阳性对照为鲤春病毒血症病毒感染细胞样。 三、讨论 本轮草鱼“怪病”疫情流行范围广，且主要为大规格草鱼，再加上早春草鱼行情低迷、养殖户惜售等因素，导致大规格草鱼存塘量大，养殖户损失惨重。疫情经自媒体报道后迅速引起相关从业人员的注意。总结已有的疫情分析和处置报告，尽管不同从业者给出的诊断结果与处置方案差别较大，但本轮疫情的发病特点较为明显。主要表现为病程急、死亡量大，死亡个体规格大，体表受伤明显，脏器内可分离出多种条件致病菌。本案例所表现出的临床症状、发病历程等特点与全国其它地方暴发的草鱼疫情非常相似，具有一定的代表性。 本案例中，均自患病鱼脏器或病症中分离出了以气单胞菌为主的条件致病菌，部分患病鱼分离出芽孢杆菌等常见的“益生菌”或肠道细菌。鉴于本案例中分离的细菌对水产常用的多种抗生素敏感，而曾用抗生素处理亦未能有效控制疫情，推测细菌感染不太可能是本例草鱼死亡的主要病因。这与养殖一线反馈的抗生素处理不能有效控制疫情的情况也较为相符，提示本轮草鱼疫情的主要病因并非细菌感染。病毒检测结果显示这些患病鱼均携带SVCV，使得分析引起本轮草鱼疫情的发病原因更为复杂。测序显示该病毒分离株同SVCV强毒株序列一致，而与弱毒株序列差别较大，提示病毒感染也是不容忽视的重要病因。SVCV感染可引起鲤、鲫及四大家鱼的暴发性死亡，其发病水温介于13-20℃，最适水温为16-17℃，超过22℃一般不发病。随着水温的升高，在控制好细菌等继发感染的前提下，推测本轮草鱼疫情将趋于稳定。 疾病的发生与环境、病原以及宿主密切相关。去年年底的低迷行情导致不少养殖户不愿投入，疏忽了池塘管理，使得鱼体免疫力下降，池塘水体污染严重，可能也是是本轮草鱼疫情暴发的重要诱因。 |
